Este reformador escocés es reconocido como el fundador del presbiterianismo. En 1540 se ordenó sacerdote y ocupó diversos cargos en la curia de Saint Andrews.

Knox adscribe al protestantismo después de conocer a George Wishart, reformista escocés,  participando activamente del movimiento reformador.

Su pensamiento estuvo influenciado tanto por la línea luterana como calvinista, así como de Martin Bucer, en particular sobre su punto de vista acerca de la Cena del Señor. Su intensa actividad como reformador y patriota lo confrontó directamente con las casas francesas católicas que dominaban Escocia, como consecuencia de esto, Knox fue perseguido y tuvo que buscar protección en el castillo de Saint Andrews.

Desde 1555 Knox  desempeñó una labor fundamental en la propagación de la Reforma en Escocia con fuerte acento calvinista. En 1560 logró que el Parlamento aprobara la Confessio Scotica (confesión de fe de la Iglesia Presbiteriana Escocesa), donde se perfilaban ya los principios del presbiterianismo, movimiento protestante que se caracterizó por una acentuación de la forma de organización eclesial propuesta por Calvino. Redactó asimismo el Book of Discipline (Libro de disciplina).

Su permanente oposición a la corte, dividida entre la facción protestante y la católica, puso muchas veces en peligro su seguridad y, finalmente, hubo de retirarse al castillo de Saint Andrews, desde donde continuó sus vigorosas predicaciones casi hasta el fin de su vida. De entre sus obras sobresale History of the Reformation in Scotland (Historia de la Reforma en Escocia), un inapreciable documento sobre la época y sobre el austero carácter de su autor.